Desarrollo y aplicacion de PCR multiple para la deteccion simultanea de tres virus de ADN en camote (Ipomoea batatas L.) uri icon

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  • El virus colusivo del camote (SPCV, genero Cavemovirus), el virus del aclaramiento de venas del camote (SPVC, genero Solendovirus) y el virus del enrollamiento de hojas del camote (SPLCV, genero Begomovirus) son virus con genoma de ADN, presentes en el camote en infecciones virales simples o multliples. La identificacion y deteccion de estos virus es complicada, ya que con frecuencia son asintomaticos y estan en concentraciones bajas en las plantas de camote. Se desarrollo una PCR multiple (mPCR) con el objetivo de lograr la deteccion simultanea de SPVC, SPVCV y SPLCV (y Begomovirus relacionados); para ellos se seleccionaron cebadores especificos para SPCV y SPVCV, y se utilizaron cebadores degenerados para Begomovirus (desarrollados por Li et al. 2004). Para la optimizacion de parametros se usaron plantas de camote con infecciones simples y mixtas. Se optimizo la concentracion de cebadores (0,1-0, 3uM), MgCl2 (2,5-8,0mM), dNTPs (0.2-0.8 mM), Taq-polimerasa (2-4U), parametros en el termociclador (temperatura de hibridacion de 48-62 oC y el numero de ciclos de 29-35), y la cantidad de acidos nucleidos (50-300 ng). Para validar le mPCR se uso plantas de camote de una coleccion de germplasma in vitro que estaban infectados con los virus en estudio y fueron confirmados por clonacion y secuenciamiento de las amplificaciones obtenidas. Los pares de cebadores especificos seleccionados para cada virus pudieron amplificar fragmentos de ADN en tamanos esperados, a una concentracion final de 0.16 uM para cebadores de SPCV y SPVCV, y 0.2uM para SPLCV. Ademas la concentracion de ADN adecuada esta entre 50-100 ng, con 30 ciclos termicos y 53 oC de temperatura de hibridacion. Este ensayo demostro ser simple, sensible y confiable para el diagnostico de rutina de SPCV, SPVCV y SPLCV (y Begomovirus relacionados). El ensayo de mPCR sera util para programas de cuarentena, como un metodos rapido y rentable para un gran numero de muestras

publication date

  • 2013